Исследования японских учёных

Sanetaka Shirahata, Shigeru Kabayama, Mariko Nakano, Takumi Miura, Kenichi Kusumoto, Miho Gotoh, Hidemitsu Hayashi, *Kazumichi Otsubo, **Shinkatsu Morisawa, **Yoshinori Katakura

Институт Сотовой Технологии Регулирования, Аспирантура Генетической Технологии Ресурсов, университет Kyushu, 6-10-1 Hakozaki, Higashi-ku, Fukuoka 812-81, Япония; *Водный Институт, Nisshin Building 9F 9F, 2-5-10 Shinjuku, Токио 160, Япония; и ** NihonTrimCo. Ltd., Meiji Seimei Jusou Building 6F, 1-2-13 Shinkitano, Yodogawa-ku, Osaka 532, Япония

До сих пор особенности ни восстановительной воды, ни окисленной воды не были хорошо разъяснены. С 1985 года, основанный на интересном клиническом улучшении множества болезней за счёт потребления восстановительной воды, Hayashi предложил гипотезу "Теория Регулирования Воды"(3). Здесь, основываясь на его теорию, в первую очередь мы демонстрируем, что восстановительная вода очищает активные кислородные разновидности и защищает ДНК от повреждения кислородными радикалами.

Издание 234, № 1, 1997 год

БИОХИМИЧЕСКАЯ И БИОФИЗИЧЕСКАЯ СВЯЗЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

В то время вода электролизовалась различными напряжениями с помощью устройств электролиза (тип TI - 7000S и TI-7000SL, Nihon Trim Co., Osaka), оборудованных титановым электродом сплатиновым покрытием для производства восстановительной воды, отображая различные редокс-потенциал параметры, замеряемые редокс-потенциал измерительным устройством (тип HM-14P), EC-метр (CM-14P), DO-метр (DO - 14P), и DH-метр (DHDI-1) от To a Electronics Ltd. (Токио) при 257C. pH фактор был измерен, используя pH-метр (Beckman, тип pHI32) при 257C. Испытание подобного действия были выдержаны для восстановительной воды, аскорбиновой кислоты, (/) - катехин и дубильная кислота. Смесь реакции (1 мл) для измерения chemiluminiescence (CL) специфика интенсивности для O • 02 содержал 500 мм hypoxanthine (HX), 200-миллиметровый EDTA, 40-миллиметровый буфер фосфата натрия (pH фактор 7.0), 0,6 мл восстановительной воды или Na OH того же самого pH фактора как восст. вода, 2.5 мм2 метила 6-ти фенилов 3,7 dihydroimidazo [1,2-a], pyrazin-3-один (аналог Cypridinaluciferin (CLA), Tokyo Kasei Industrial Co., Токио) и 0.5 U/l xanthine оксидазы (XOD), (Wako Pure chemical Industries, Токио). Интенсивность CL смеси реакции (0,85 мл), за исключением раствора XOD была измерена в стеклянной трубке в CL (Aloka, тип BLR- 301) при 26 7C. К моменту времени в 18 секунд 0,15 мл раствора XOD были введены в трубку, и интенсивность CL непрерывно измерялась в течение 120 секунд. Изменение интенсивности CL в присутствии восстановительной воды, SOD, полученный из бычьихэритоцитов (Sigma), AsA (ако), (/) - катехин (Вако) или дубильная кислота (Wако), было измерено системой HX-XOD, чтобы оценить очищающее действие O • 02. Сильно восстановленная вода (РП, 0820 мВ; pH фактор 11.0), была разбавлена раствором Na OH (pH фактор 11.0), чтобы гарантировать тот же самый заключительный pH фактор смеси реакции (pH фактор 7.3) среди испытательных образцов. Уровень гашения O • 02 (%) был вычислен, деля полную интенсивность CL испытательного образцас контролируемым.

Анализ катализа подобного рода действия для восстановительной воды и AsA. Смесь реакции (100 мл) системы HX-XOD, описанной выше в присутствии или отсутствии SOD или восстановительной воды были помещены в 96 микропластин и инкубированы при 37,7 градусах по Цельсию. Курс времени изменения в концентрации H2O2 был измерен дополнением 200 мл основания, содержащего пероксидаз (0,3 мг/мл 2,2*-azino-di-3-ethylbenzthiazolin sulfonic кислота), буфер соли лимонной кислоты на 0,1 М, pH фактор 4.0, streptavidine-horse radish peroxidase сопряжение (Amersham), растворенный в 1000 раз). Поглотительная способность продукта реакции была измерена в 405 нм считывателем ELISA. Чтобы исследовать подобное катализ-действие, раствор H2O2 был непосредственно инкубирован с раствором Na OH (pH фактор 11.0). Восстановил воду (pH фактор 11.0), AsA или катализ (Wako) в 40-миллиметровом буфере фосфата натрия (pH фактор 7.0) при 37,7 градусах по Цельсию, где были обнаружены концентрации H2O2. Анализ одножильного измельчения ДНК, вызванный активными кислородными разновидностями, произведенными медью (II) - катализированным окислением AsA. Курс времени реакции повреждения единственной цепочки ДНК, вызванной медью (II катализированного окисления AsA был исследован при помощи суперобмоточного ДНК плазмида.Один мг p Bluescript II ДНК plasmid (Stratagene, La Jolla, Калифорния) был выведен со смесью 25-миллиметрового AsA и 25-миллиметрового Cu SO4 в 20 мл 20-миллиметрового буфера фосфата натрия (pH фактор 7.5), содержащий 17 мл восстановительной воды, раствора Na OH того же самого pH фактора как и восст. вода, SOD, катализ, 2 - (Aminoethyl) isothiuronium (AET) (Wako), KI (Wako) или Na N3 (Wako) при 37,7 градусах по Цельсию, в течение различных промежутков времени. Реакция была остановлена, добавив 4 мл 15-миллиметрового EDTA (pH фактор 7.0). Суперобмоточный ДНК, открыто-круговой ДНК и линейный ДНК были разделены электрофорезом с 1%-м гелем агарозы, и любые изменения суммы суперобмоточного ДНК были определены фото изображениями на базе программного обеспечения NIH

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Особенности электролизной - восстановительной воды. Принцип электролиза был основан Майклом Фарадеем (1791-1867). В этом процессе восстановление происходит в катоде и окисление в аноде. Разобщение H2O производит H/и ионы OH0. В катоде ионы H/ получают электроны, чтобы поменяться в активный атомный водород (H). Активный атомный водород показывает высоко восстановительный потенциал. Только после этого происходит изменение на водородные молекулы (H2), которые химически инертны при комнатной температуре. В аноде ионы OH0 теряют электроны для формирования OH, который приводит к производству O2 и H2O. Катодная щелочная вода(восстановительная вода) изобилует DH, тогда как анодная кислая вода (окисленная вода) изобилует DO. Соотношения РП с pH фактором, DO, и DH в восстановительной воде. Заметные изменения в этих значениях происходят в воде после электролиза. Нужно заметить, что значение DH выше в восстановительной воде, чем в исходной воде на два порядка величины. SOD-подобное действие восстановительной воды. XOD окисляет HX-xanthine, связывая к генерации O • 02 из O2. CLA определенно реагирует с O • 02 и 1O2 и испускает CL. Восстановительная вода полностью исключила CL, демонстрируя SOD как действие восстановительной воды. Так как CL был полностью запрещен SOD, CL был специфическим для O • 02.

Пузырение водородного газа в растворе Na OH (pH фактор 10.5) в течение 5 минут привело к заметным изменениям РП от +116 мВ до-842 мВ; DO от 7,66 мг/л до 1.98mg/l; DH от 0,0002 мг/л до 0,938 мг/л; но никаких изменений pH фактора. Пузырение газа азота в растворе Na OH (pH фактор 10.5) привело к изменениям РП от +116 мВ до/83 мВ; DO от 7,66 мг/л до 1,82 мг/л; DH от 0,0002 мг/л до 0,0001 мг/л; никаких изменений pH фактора. Вода была переполнена водородным газом (вода H2), и газ азота (N2-вода) показал восстановительную интенсивность CL приблизительно на 20% по сравнению с контролируемым образцом в устойчивом состоянии, предположив, что восстановительная интенсивность CL в N2-воде и воде H2 была из за низкого DO и у воды H2 не было подобного SOD действия. Подобное SOD действие восстановительной воды сохранено во время хранения, хотя РП и DH показывают затухание. Эти результаты ясно указывают на то, что распавшийся молекулярный водородный газ в восстановительной воде был ответственен за отрицательное значение РП, но не за подобное SOD действие.

Устойчивость SOD-подобного действия восстановительной воды. Подобное SOD действие восстановительной воды было очень стабильно в закрытой стеклянной бутылке в 47 градусах по Цельсию больше месяца. Действие не было потеряно даже после нейтрализации, повторного замораживания и таяния, дефляции с ультразвуком на протяжении 10 минут, повторенной фильтрации с 0,22-миллиметровым фильтром, кипящим в течение 10 минут или обрабатывающимся в автоклаве в закрытой стеклянной бутылке при 1217 градусах по Цельсию в течении 20 минут. Однако 90% подобного SOD действия было потеряно, пройдя обработку в автоклаве в открытой стеклянной бутылке, предположив, что активное вещество в восстановительной воде энергозависимо. Атомный водород энергозависим и может восстановить металлическую окись, такую как вольфрамовая триокись, хотя молекулярный водород не может легко сделать этого.

Чувствительный метод обнаружения атомного водорода основан на цветном изменении вольфрамовойтриокисивосстановлением. Закрытое обрабатывание в автоклаве восстановительной воды с вольфрамовой триокисью при 121 градусах по Цельсию в течении 20 минут привело к потере 52% подобного SOD действия. Эти результаты убедительно предполагают, что вещество, ответственное за подобное SOD действие восстановительной воды, является активным атомным водородом. Активный водород в газовой фазе имеет довольно стабильный учет уровня аварийности. Так как у двух атомов водорода в стандартном состоянии имеется больше энергии, чем у молекулярного водорода в любом устойчивом состоянии, требуется дополнительная энергия, чтобы быть устраненной третьим веществом, дабы произвести водородную молекулу из двух атомов водорода. Атомный водород может устойчиво существовать при комнатной температуре в течении долгого периода, не меньше чем год. Пар воды, как известно, предотвращает перекомбинацию атомного водорода на вольфрамовой поверхности. Особенность активного атомного водорода в водном растворе, произведенного электронным выбросом, до сих пор изучается. Когда раствор XOD был введен в смесь реакции, содержащую разбавленную восстановительную воду,сразу после внедрения был испущен сильный CL. Ингибирующий эффект восстановительной воды на накопление O • 02 был увеличен зависимым от дозы способом, предложив стехиометрическое действие активного вещества в восстановительной воде. Определение подобного SOD действия восстановительной воды. Так как данная статья первоначально сообщает о O • 02 очищающих действиях электролизной - восстановительной воды, стандартизация этого действия необходима для выдержки сравнения, уменьшающего потенциал восстановительной воды. Чтобы стандартизировать потенциал восстановительной воды, мы обозначили модуль IC 50 SO как восстанавливающий потенциал, с помощью которого восстановительная вода может очистить 50% O • 02 произведенных системой HX-XOD и IC 50 SO (%) как концентрация (%) восстановительной воды, в которой 50% отO • 02 системы HX-XOD очищен. В системе HX-XOD, используемой здесь, приводятся такие значения как IC 50 SO из SOD, AsA, (/) - катехин и дубильная кислота были 0.05 U/ml, 3 мм (0,53 мг/мл), 130 мм (38 мг/мл) и 33 мг/мл.

Действие подобное каталазу для восстановительной воды. Хоть восстановительная вода и могла очистить O • 02, была возможность, которая способствовала бы восстановительной воды запретить действие фермента XOD или запретить реакцию между O • 02 и luciferin аналоговым реактивом. Чтобы устранить эту возможность, производство H2O2 было определено в системе HX-XOD. В этой системе HX-XOD, XOD может произвести не только O • 02, но также и H2O2. XOD произвел H2O2 даже в присутствии восстановительной воды, не демонстрируя запрещения действия фермента восстановительной водой. Как ожидалось добавление SOD к системе HX-XOD привело к накоплению H2O2. Восстановительная вода сперва накопила H2O2 и затем постепенно понижала концентрацию H2O2, предлагая, что восстановительные водные проявления не только SOD действие, но также действие подобное каталазе. Факт, что восстановительная вода стимулировала накопление H2O2 в системе HX-XOD за первые 5 минут указал на то, что восстановительная интенсивность CL в присутствии восстановительной воды не происходит из-за запрещения реакции между O • 02 и luciferin аналогом от восстановительной воды, но из-за преобразования O • 02 в H2O2 за счёт восстановительной воды. Чтобы продемонстрировать подобное катализ действие восстановительной воды, H2O2 был непосредственно инкубирован с восстановительной водой. Восстановительная вода очистила H2O2, а также AsA и каталазу.

Супрессивный эффект восстановительной воды на одножильное измельчение ДНК, вызванный медью (II) - катализированным окислением AsA. Одножильное измельчение ДНК вызвана смесью AsA и медью (II). Медь (II) катализировала окисление AsA, что производит O • 02 и H2O2, которые реагируют, чтобы произвести • OH. Чтобы продемонстрировать, что восстановительная вода может очистить не только O • 02 и H2O2, а также и другие активные кислородные разновидности, мы исследовали эффект восстановительной воды на измельчение ДНК, вызванное смесью AsA и меди (II). Суперобмоточный ДНК плазмид (форма I) изменяется на открыто-круговом ДНК (форма II) одножилистым измельчением. Открыто-круговой ДНК изменяется на линейной ДНК (форма III) двойным, поломка цепочки ДНК. Когда ДНК плазмид был инкубирован со смесью AsA и меди (II), количество суперобмоточного ДНК постепенно уменьшился.

Восстановительная вода запретила реакцию повреждения ДНК зависимым от дозы способом. Каталаза также запретила повреждающуюся реакцию, SOD не сделал этого, указав, что H2O2 участвовал в повреждающейся реакции. Оба радикальных очистителя, определенные для • OH или 1O2 запретили повреждающуюся реакцию.

Эти результаты указали, что восстановительная вода может предотвратить ущерб ДНК, который может быть нанесен активными кислородными разновидностями, такими как H2O2, • OH, и 1O2 произведенный медью (II) - катализированный окислением AsA. Значительный синергетический эффект между восстановительной водой и радикальными очистителями, использованными здесь,не известен (нет данных). Примечательно, что восстановительная вода может предотвратить повреждение ДНК даже в присутствии металлических ионов, которые катализируют авто-окисление самых крепких антиоксидантов и полностью изменяют их защитный эффект против активных кислородных разновидностей. Однако у воды должна быть более высокая способность к восстановлению, чем очистка O • 02. Хоть и аэробные организмы развились за счёт способности использовать кислород, кислород - преимущественно токсичное вещество. Недавно сообщалось о биологической активации водорода с помощью гидрогенеза. Гидрогенезы, которые являются одними из самых старых ферментов (3,8 миллиарда лет), могут обратимо разделить молекулярный водород, чтобы произвести активный атомный водород. Активный атомный водород, возможно, участвовал в окислительно-восстановительном регулировании клеточных функций. Вода может проникать везде в теле и проникает через каждую мембрану, включая гематоэнцефалический барьер. Чтобы нейтрализовать токсичное действие активных кислородных разновидностей, электролизная - восстановительная вода может быть идеальным и очень сильным антиокислителем. Далее для интенсивного изучения эффекта восстановительной воды должно быть развито направление в клеточной биологии, иммунологии и онкологии. Издание 234, № 1, 1997 год

БИОХИМИЧЕСКАЯ И БИОФИЗИЧЕСКАЯ СВЯЗЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Список литературы:

1. Sohal, R. S., and Weindruch, R. (1996) Science 273, 59–63.

2. Feig, D. I., Reid, T. M., and Loeb, L. A. (1994) Cancer Res. 54, 1890s–1894s.

3. Hayashi, H. (1995) Explore 6, 28–31.

4. Nakano, M., Sugioka, K., Ushijima, Y., and Goto, T. (1986) Anal. Biochem. 159, 363–369.

5. Gadgil, K., and Gonzalez, R. D. (1975) J. Catal. 40, 190–196.

6. Austin, L. G. (1961) Ind. Eng. Chem. 53, 659–661.

7. Tanaka, T. (1969) Chemistry of Free Radical, Iwanami Shoten.

8. Langmuir, I. (1927) Ind. Eng. Chem. 19, 667–674.

9. Sasamori, R., Okaue, Y., Isobe, T., and Matsuda, Y. (1994) Science 265, 1691–1693.

10. Shinohara, K., So, M., Nonaka, M., Nishiyama, K., Murakami H., and Omura, H. (1983) J. Nutr. Sci. Vitaminol. 29, 481–488.

11. Chiou, S.-H. (1983) J. Biochem.94, 1259–1267.

12. Scarpa, M., Stevanato, R., Viglino, P., and Rigo, A. (1983) J.Biol. Chem. 258, 6695–6697.